ФІЗІОЛОГІЯ РОСЛИН. ПРАКТИЧНІ ЗАНЯТТЯ.

Заняття 1. Вивчення будови клітин лусок цибулі за допомогою мікроскопа

Розріжте навпіл цибулину і вийміть одну внутрішню білу луску. Взявши луску в ліву руку опуклим боком догори, кінчиком гострої голки трохи підніміть шкірку на ній, надірвавши її, притисніть пальцем до голки і обе­режно зірвіть з луски. У тому місці, де почали зривати шкірку, шари клітин зруйнуються; на протилежному ж кінці шкірка буде непошкоджена. Покла­діть її на предметне скло в краплю води зовнішнім боком догори і добре розправте голками, щоб вона не була зім'ята. Розправивши, накрийте на­кривним скельцем так, щоб під нього не попали пухирці повітря, бо вони заважатимуть розглядати препарат під мікроскопом. Якщо під скельцем буде багато пухирців, то треба зняти його, добавити краплю води і знову обережно покласти. Воду краще брати кип'ячену: в ній менше міститься пухирців повітря.

Розгляньте препарат під мікроскопом спочатку при малому, а потім при великому збільшенні. Ви побачите, що шкірка складається з вузьких ви­довжених клітин, які щільно прилягають одна до одної.

Оболонки клітин шкірки цибулі дуже тонкі, безбарвні й прозорі. Все­редині кіітини є більш чи менш крупні вакуолі з безбарвним клітинним соком і дрібнозерниста цитоплазма, що вистилає оболонки клітин тонким шаром і скупчується біля ядра. Шар цитоплазми і її скупчення біля ядра сполучені між собою тяжами. Ядро розміщене або в центрі клітини, або ближче до поздовжньої стінки. В ньому добре помітні одне або два ядерця.

Можна зробити ядро добре помітним, скориставшись тим, що його хроматинові нитки, які містять нуклеїнові кислоти, краще вбирають барвні речовини, ніж цитоплазма, і тому забарвлюються яскравіше. Для забарвлен­ня ядра використовують анілінову або метиленову зелень, кармін, нейтральну червону та інші речовини. З одного боку накривного скельця нанесіть краплю одного з цих барвників, а з другого боку покладіть клаптик фільтруваль­ного паперу. Крапля пройде крізь препарат, і ядро забарвиться в інтенсив­ний колір. Щоб не забарвились стінки клітин і цитоплазма, треба користу­ватися слабким розчином барвника. У забарвленому ядрі виразно висту­пають хроматинові нитки, скручені в клубочок.

Можна приготувати новий препарат з шкірки луски цибулі і вмістити його в розчин йоду в йодистому калії. Цитоплазма від цього реактиву за­барвиться в жовтий колір, а ядро — в жовто-бурий.

Якщо використовують барвник нейтральний червоний (0,05-процентний розчин), то перед цим убивають клітини, вмістивши шкірку цибулі у велику краплю води на предметному склі і обережно нагріваючи її на спиртівці.. Оброблений так зріз вміщують у краплю нейтрального червоного і, зали­шивши на 10 хв без накривного скельця, спостерігають під мікроскопом при малому збільшенні. Потім накривають скельцем і розглядають, при біль­шому збільшенні. Ядро забарвиться інтенсивніше за цитоплазму..

Заняття 2. Розгляд епідермісу листка традесканції або пеларгонії рожевої

Епідерміс, або шкірка, належить до покривних тканин. Він захищає рослину від надмірного випаровування води, через нього підтримується по­стійний зв'язок рослини з зовнішнім середовищем, відбувається газообмін. Будова епідермісу пов'язана з цими функціями.

Візьміть листок традесканції або пеларгонії, введіть голку під нижній епідерміс листка і, притиснувши її пальцем, обережно підніміть. Епідерміс зніметься у вигляді тонкої прозорої плівки. Покладіть її на предметне скло в краплю води, обережно розправте голками і накрийте скельцем. Спочатку розгляньте препарат при малому збільшенні мікроскопа. Видно, що епідерміс складається з прозорих клітин. Обриси клітин епідермісу пеларгонії звивисті, внаслідок чого клітини зв'язані міцніше. Клітинна оболонка злегка потов­щена. Місцями на епідермісі видно продихи.

При великому збільшенні мікроскопа в клітинах видно цитоплазму, ядро, вакуолі, іноді з забарвленим клітинним соком. Цитоплазма мі­ститься біля стінок клітин. Часто в ній трапляються безбарвні пластиди — лейкопласти, зрідка — хлоропласти (пластиди зеленого кольору). Хлоропласти звичайно бувають у замикаючих клітинах продиху. Продих — це вузька щілина, отвір в епідермісі, облямований двома невеликими вигнутими, так званими замикаючими, клітинами. Через продихи здійснюється зв'язок внутрішніх тканин листка із зовнішнім середовищем.

Захисна функція епідермісу підсилюється додатковими утворами — во­лосками, кутикулою, восковим нальотом. Волоски на епідермісі є в багатьох рослин. Розрізняють два види їх — покривні й залозисті. Залозисті волоски мають тонкі стінки, містять вакуолізовану цитоплазму, велике ядро. В зов­нішнє середовище вони виділяють продукти життєдіяльності рослини — воду, ефірні олії та ін. Пеларгонія рожева—зручний об'єкт для вивчення залози­стих волосків.

Заняття 3. Мікрохімічні реакції на білки, жири і вуглеводи

Білки, жири і вуглеводи серед запасних речовин у рослинах виявляють так званими якісними реакціями, наприклад, на крохмаль діють розчином йоду в йодистому калії.

Об'єктами для виявлення глюкози і фруктози можна взяти корені моркви, цибулину цибулі, плоди груші, винограду, дині; для крохмалю — зернівки злаків, насіння бобових, бульби картоплі; для жирів — насіння соняшника, рицини, конопель, льону; для виявлення білків — насіння люпину та інших бобових. Насіння обов'язково повинно бути набубнявіле.

Реакції проводять на зрізах, покладених на предметне скло. Для кожної реакції беруть свіжий зріз.

Глюкозу і фруктозу виявляють рідиною Фелінга, яку приготовляють так: у 500 мл дистильованої води розчиняють 130 г їдкого натрію, 105 г винної кислоти та 80 г їдкого калію. Потім у 300 мл дистильованої води розчиняють 40 г мідного купоросу. Після охолодження розчини змішують і доливають водою до 1 л.

Зрізи моркви або іншої рослини (не дуже тонкі, в 3—4 шари непо-шкоджених клітин) сполощіть у воді, покладіть на предметне скло в краплю розбавленої рідини Фелінга і обережно нагрійте. Якщо в моркві є глюкоза і фруктоза, то в краплі рідини утвориться цегляно-червоний осад міді.

Крохмаль виявляють розчином йоду в йодистому калії. Цей розчин приготовляють так: у 5 мл води розчиняють 2 г йодистого калію, потім добавляють 1 г кристалічного йоду і, коли він розчиниться, доливають 295 мл дистильованої води. Розчин зберігають у темній склянці.

На зріз бульби картоплі нанесіть краплю цього розчину. Картопля за­барвиться в синій колір.

Жир можна виявити на зрізі насінини, розглянувши його під мікроско­пом. Краплинки жиру помітні у вигляді блискучих блакитно-сірих кульок, оточених тонкою темною каймою. Від пухирців повітря, що є у воді, вони відрізняються кольором і вужчою та світлішою каймою.

Білки виявляють кольоровими реакціями.

1.Мілонова реакція. На предметне скло нанесіть краплю щойно при-
ютовленого мілонового реактиву і покладіть у неї зріз насінини. Обережне
нагрійте скло над полум'ям спиртівки. Якщо в насінині є білок, то зріз
забарвиться в червоний колір.

Мілоновий реактив приготовляють так: нітрат ртуті розчиняють в кон­центрованій азотній кислоті (в однаковій за вагону кількості). Розчин роз­бавляють водою: на один об'єм розчину ртуті — один об'єм води. Усе це роблять під тягою.

2.Зріз насінини покладіть на предметне скло в краплю гліцерину, до
якого добавте краплю розчину йоду в йодистому калії. Накрийте зріз на-
кривним скельцем і розгляньте під мікроскопом. Від розчину йоду білок
забарвлюється в золотаво-жовтий колір.

Заняття 4.  Виділення ферменту сахарази з дріжджів

Близько 10 г пресованих дріжджів змішайте з невеликою кількістю про­митого річкового піску, облийте 5 мл води і ретельно розітріть у фарфоровій ступці. Потім долийте ще 15 мл води, підігрітої до 60°С, і продовжуйте розтирати протягом 10 хв. Розчин профільтруйте через складчастий фільтр, змочивши його перед цим гарячою водою. Перші порції каламутного розчину злийте знову на фільтр. У профільтрованій рідині буде фермент сахараза, під дією якого сахароза гідролізується до глюкози й фруктози.

Щоб переконатися в цьому, налийте у три пробірки по 10 мл 1-процент-ного розчину цукру, одну порцію залиште для контролю, в другу добавте 1 мл профільтрованого розчину, в третю — 1 мл цього розчину, але про­кип'яченого. Усі три пробірки помістіть у водяну баню з температурою 40°С. (Можна використати емальовані посудини з налитою в них водою потрібної температури. В міру охолодження доливайте гарячу воду).

Через 15—20 хв пробірки вийміть і з усіма трьома порціями проробіть реакцію на виявлення моносахаридів, застосувавши рідину Фелінга. Якщо відбувся гідроліз сахарози, то при доливанні рідини Фелінга та кип'ятінні розчину випаде цегляно-червоний осад закису міді.

Коли немає приготовленої рідини Фелінга, виявити глюкозу і фруктозу можна за допомогою реакції Троммера. Цю реакцію проводять так: до досліджуваного розчину добавляють краплю 6—7-процентного розчину мід­ного купоросу і 1 мл 10-процентного розчину їдкого натрію, потім підігрі­вають розчин до кипіння. Якщо в ньому є глюкоза чи фруктоза, окисні сполуки міді відновлюються до закису міді, утворюється цегляно-черво­ний осад.

рено холодильні установки, в яких можуть роками зберігатися різні продукти.

Радянські вчені вивчають життєдіяльність мікроорганізмів, щоб підсилювати їх корисну дію і запобігати шкідливій дії. Вони продовжують пошуки нових корисних мікроорганізмів, які б за продуктивністю перевершували ті, що існують тепер.

Завдяки простій будові віруси й бактерії використовують тепер як живі моделі для вивчення важливих питань біології: синтезу білків, нуклеїнових кислот, спадковості.

Заняття 5. Дослідження мікроорганізмів із застосуванням барвників

Забарвлених мертвих бактерій розглядати зручніше, ніж живих. Щоб приготувати забарвлений препарат, на предметному склі роблять мазок, ви­сушують його, фіксують і після цього фарбують.

Мазок приготовляють так. Досліджуваний матеріал розподіляють тонким шаром по поверхні предметного скла, бо в товстому мазку мікроби нашаро­вуються один на одного. На одному предметному склі можна зробити один або кілька мазків. Кожний мазок на зворотному боці скла обводять олівцем, щоб не покласти скло мазком униз.

Якщо досліджується сінний настій, гноївка, вода, в якій довго стояв букет квітів, вода з акваріума, що давно не чистився, то для мазка беруть скляною паличкою з поверхні невелику краплину рідини і розмазують її паличкою по поверхні скла. Чекають, поки мазок на склі висохне. Фіксують краплю сухим жаром, для чого проводять предметне скло, мазком догори, крізь полум'я спиртівки плавним коловим рухом 3—5 разів. При цьому мікроби гинуть і прилипають до предметного скла.

Якщо мазок виготовляють з культур, вирощених на густих живильних середовищах, то на чисте, добре знежирене скло наносять невелику краплю водопровідної води і в неї занурюють петлю (дротик із загнутим у вигляді петлі кінцем, заправлений у скляну паличку) з культурою мікробів, знятою з поверхні м'ясопептонного агару (МЛА) або іншого густого живильного середовища. Культуру розтирають так, щоб крапля води стала каламутною. Після цього залишок культури на петлі спалюють у полум'ї пальника і «стиглою петлею розподіляють краплю з бактеріями по склу у вигляді кру­жальця діаметром 1,5—2 см. Мазок фіксуть у полум'ї пальника.

Виготовлені таким способом мазки фарбують метиленовою синьою, кар­боловим фуксином або звичайним фіолетовим чорнилом, розбавленим водою у відношенні

1 : 2.

Фарбу наносять піпеткою в такій кількості, щоб вона вкрила весь мазок. Через 1—2 хв мазок промивають у воді, залишки води знімають з нього «фільтрувальним папером.

На препарат наносять краплю імерсійної олії (можна замінити її рици­новою або соняшниковою олією) і розглядають його під мікроскопом, засто­сувавши імерсійну систему. Фронтальну лінзу системи обережно занурюють г олію. Мікроскоп наводять на фокус і розглядають препарат при відкритій діафрагмі конденсора.

Після роботи треба витерти імерсійну систему чистою ганчіркою, злегка змоченою в бензині або ксилолі.

Заняття 6. Вивчення мікрофлори повітря

Для дослідження мікрофлори повітря треба мати стерильні чашки Петрі і стерильний м'ясопептокний агар у пробірках.

Чашки  Петрі  простерилізуйте сухим  жиром.  Для  цього  їх обгорніть (кожну окремо) тонким обгортковим або газетним папером, покладіть одну на одну в сушильній шафі і тримайте у ній при температурі 160°С 1,5—2 годА У простерилізовані чашки розлийте стерильний матеріал — м'ясопептонни;: агар з пробірок.

М'ясопептонний агар приготовляють так. Свіже м'ясо очищають вії жиру, кісток, сухожилля, дрібно ріжуть ножем або пропускають через м'ясо­рубку. Фарш кладуть у каструлю або колбу, заливають водопровідною водо:-: (води беруть у два рази більше, ніж м'яса) і тримають 24 год в прохолод­ному місці. Потім м'ясний настій зливають і кип'ятять на слабкому вогні, фільтрують крізь чисту ганчірку або паперовий фільтр і розливають у бутлі. Закривши бутлі ватно-марлевими пробками, стерилізують настій протято:-: 20 хв при температурі 120°С. Стерильна м'ясна вода може зберігатися дуже довго.

Добавивши до м'ясної води 0,5% кухонної солі, 1% пептону, 2% агару, нагрівають розчин на слабкому вогні до повного розчинення агару. Гарячий бульйон з агаром охолоджують до 40—45°С і нейтралізують 10-процентним розчином соди до слаболужної реакції на лакмус (бактерії краще розви­ваються на слаболужних або нейтральних середовищах, гриби — на слабо-кислих). Потім розливають у пробірки по 4—5 мл і, закривши їх ватнимв пробками, стерилізують у водяній бані протягом 20 хв.

Рідкий м'ясопептонний агар виливають у стерильну чашку Петрі. Він застигає, утворюючи так звану агарну пластинку. її використовують для вловлювання зародків мікроорганізмів з повітря. Щоб провести аналіз по­вітря в приміщенні, відкрийте чашку Петрі з агарною пластинкою, причому кришку чашки тримайте краями вниз. Потім закрийте чашку, напишіть на ній спеціальним олівцем («Стеклограф») дату взяття проби і поставте в тепле місце, а краще — в термостат. Через 2—3 дні на поверхні живильного середовища з'являться колонії мікроорганізмів найрізноманітнішого забарв­лення: рожеві, кремові, коричневі, білі. Дікаво провести порівняльне дослі­дження мікрофлори повітря в різних шкільних приміщеннях. Для досліду треба мати кілька чашок Петрі. Чашку 1 відкрийте в класі, де замітали підлогу сухим віником; чашку 2 —в класі, де замітали мокрим віником: чашку 3 — в класі, де під час перерви були всі учні і він не провітрювався: чашку 4 — в класі, де під час перерви, крім чергових, нікого не було, вікно відкрите. Чашку 5 не відкривайте, вона є контрольною. Усі 5 чашок три­майте в термостаті протягом 2—3 днів.

Порівняйте кількість колоній в різних чашках (у контрольній чашці її не буде) і зробіть висновки.

Заняття 7. Визначення чутливості мікробів до антибіотиків методом дифузії в агар із застосуванням дисків

У чашки Петрі, встановлені на горизонтальній поверхні, налийте 20 м.: 2-пропентного м'ясопептонного агару.

Після застигання агару середовище засійте культурою сінної чи кишко­вої палички або стафілокока: вилийте у чашку 1—2 мл води з бактеріями і. обережно похитуючи чашку, рівномірно розподіліть рідину по всій поверх­ні агару.

На поверхню засіяного і. підсушеного середовища накладіть пінцетом диски — кружечки з фільтрувального паперу діаметром 10 мм, просочені різ­ними антибіотиками і висушені (їх можна купити або приготувати самим). На дні чашки Петрі під кожним диском напишіть назву антибіотика, яким він просочений.

Засіяні чашки поставте в термостат, де температура 37°С, і через добу дослідіть.

Антибіотична речовина з диску переходить (дифундує) в агар, і навколо диска виникає зона пригнічення росту бактерій. Величиною зони пригнічення визначається ступінь чутливості мікроба до антибіотиків.